ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。下面來詳述解說ELISA顯色底物的區別：
HRP的催化反應需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型染料，通過反應可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應的過程如下:
HRP
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氫體的種類很多，形成的產物特點不一。
1、DAB(3.3－二氨基聯苯胺)的反應產物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。
2、5AS(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無色，現已很少應用。
3、OT(鄰聯甲苯胺)的特點是能產生鮮艷的藍綠色產物且靈敏度較高，但反應中受溫度影響較大，而且由于產物不穩定，需要在短時間內進行測定。
4、目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯苯胺)。前者形成的產物為深桔黃色或棕色，后者產物為藍綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩定，空白可近于無色，靈敏度上據報道后者比前者可高4倍以上。
5、另外，還有一種供氫體稱ABTS[2, 2'-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反應產物呈藍綠色，且靈敏度和穩定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優選的供氫體
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