酶ELISA試劑盒，即酶聯免疫吸附試驗試劑盒，是酶免疫測定技術中應用廣的技術。基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結合，這種結合不會改變抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。酶標記的抗體可以與吸附在固相載體上的抗原或抗體發生特異性結合。在加入底物溶液后，底物在酶的作用下發生顏色反應，其顏色深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。這種顯色反應可以通過ELISA檢測儀進行定量測定，從而將酶化學反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結合起來。
1、樣本準備
樣本收集：根據實驗要求確定所需的樣本量，并確保樣本的完整性和代表性。例如，每個樣本量收集體積=100ulx檢測種類，如果需要復孔，則標本量收集體積=100ulx檢測種類x2。
樣本保存：樣本收集后若在一周內進行檢測可保存于2-8°C，若不及時檢測，請進行分裝，凍存于-20°或-80°C，避免反復凍融。
樣本處理：血清樣本取樣時要注意避免溶血、脂血等樣本。如樣本條件受限，建議用樣本稀釋液適當稀釋，減少基質效應影響。
2、試劑準備
試劑平衡：ELISA試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用。
標準品制備：溶解標準品之前需短暫離心，徹d收集粉末；確保標準品完q溶解和混勻（大約10min），然后再進行后續的系列稀釋步驟，確保每一步都充分混勻且精確移液。
洗滌液配制：濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3、實驗操作
加樣準確性：各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
孵育和洗滌：孵育樣品、檢測抗體和顯色底物均需要覆蓋封板膜，減少污染和揮發，且每次使用后都要更換新的封板膜，防止交叉污染。振蕩孵育使反應更充分，振蕩洗滌使背景更干凈。
終止反應：ELISA實驗最終需要酶催化底物顯色反應來完成，在最合適的時間終止反應是ELISA實驗成功的重要因素。在HRP-TMB酶反應系統中，當最高濃度標準品顏色不再變深，倒數2-3個濃度標準品顏色開始有淺藍色時，便需要終止反應。
4、質量控制
標準曲線：每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本OD值大于標準品孔最大孔的OD值)，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數后再測定，計算時請乘以總稀釋倍數。
數據讀取：ELISA數據處理有專門的軟件，并且要核對說明書選擇合適的擬合曲線。
交叉污染防控：所有試劑和檢測樣本要平衡至室溫后再進行加樣操作；每次洗滌的步驟都要洗干凈，如果是手動洗滌，每次拍板用的濾紙都要更換，防止交叉污染。
5、環境要求
溫度控制：溫度是ELISA結合反應的重要影響因素。實驗前務必將所有試劑和檢測樣本平衡至室溫，避免因溫度差異導致ELISA檢測結果不準確。
濕度管理：試劑盒應避免潮濕，過高濕度會使酶標板變形、變質，影響檢測結果。要放在干燥、通風的地方。在使用試劑盒的過程中，也要注意保持操作環境的干燥。
